细胞融合技术是生物医学研究中的一种重要手段，常用的融合剂包括物理法（如电融合和激光融合）及化学和生物融合法。其中，化学融合法中的聚乙二醇（PEG）融合法备受青睐。PEG在分子量为200至700时呈无色、无臭的粘稠液体，而分子量超过1000时则呈乳白色的蜡状固体。其具有较高的水溶性和良好的热稳定性，对多种化学药品也不易反应。作为细胞融合剂，通常选择分子量为4000的PEG，其常用浓度为50%，pH值在80至82之间（可用10% NaHCO3进行调整）。较小分子量的PEG融合效果较差且有毒性，而分子量过大的PEG则黏性过强，操作不便。研究表明，50%浓度且pH偏碱时，融合效果最佳。此外，还可以采用30%至50%浓度的PEG配合10%二甲亚砜进行融合。尽管不同批次的PEG具有相同的分子量，但其融合率可能存在差异，因此在使用前需确保每批PEG经过细胞毒性试验确认其安全性。理想的PEG应选择高纯度的类型，如适用于气相色谱的PEG，确保实验的成功率。

在细胞融合的操作过程中，采用的融合方法多种多样，最常用的方式为转动法和离心法。在融合过程中，脾细胞与骨髓瘤细胞的比例通常为1:1至10:1，最常用的比例为3:1或5:1。

尊龙凯时的细胞融合实验需准备以下试剂与材料：（1）供融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，（2）1640培养液100ml，（3）完全1640液100ml，（4）25% FCS-1640液50ml，（5）HAT培养液100ml，（6）50% PEG：选择分子量4000、纯度高的PEG（如日本进口或Serva），10g置于25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热至40℃的1640液10ml混合并进行pH检查，若有变化可用HCl或NaHCO3调整，（7）10ml与50ml的灭菌沉淀管或瓶，（8）40孔塑料培养盘。

接下来的操作步骤包括：（1）准备脾细胞，（2）在50ml沉淀管中混合10⁸脾细胞和10⁷小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml的25% FCS-1640液，（3）在室温下以400g的离心力离心3分钟使细胞沉淀，（4）移除上清液，（5）轻敲管底部使沉淀流动，并将沉淀管放入40℃水浴中以达到融合温度，（6）加入预热至40℃的50% PEG 8ml，缓慢滴加并摇动沉淀管，观察可见颗粒出现；滴加过程应持续2分钟，（7）加入1ml的1640液并保持摇动，持续1分钟，（8）重复第（7）步一次，（9）再加入1ml的1640液，频率与之前相同，持续0.5分钟，（10）再重复一次第（9）步，（11）最后加入1640液15ml，（12）在室温下以400g离心1分钟进行细胞沉淀，（13）去除上清液，底部轻敲后加入25ml含HAT的完全1640液，（14）向前一天培养的40孔塑料培养盘中每孔加入一滴融合细胞液（约0.05ml），（15）轻摇后放入5% CO2、饱和湿度的37℃温箱中培养，（16）在第3、6、9、10日更换为含HAT的完全1640培养液，并注意轻吸上清液，避免吸出固定在孔底的细胞，根据需要添加适量饲养细胞，（17）在第12、15日再次更换为含HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，通常约在10天左右可见杂交瘤细胞的生长，大多数杂交瘤细胞会在10至20天内出现，但也有一些可能在一个月内才会显现。发现杂交瘤细胞后，取上清液进行抗体检测。

随着杂交瘤细胞的持续生长，可进行增殖传代。在传代过程中，根据需要可取消HAT液和完全1640液，改用10% FCS-1640液。同时，应在液氮中保存并进行克隆化，确保每代都检查抗体，以防止抗体细胞的变异与丢失。

在细胞融合过程中，有几个关键因素需要注意：（1）技术误差可能导致融合失败。例如，如果供者淋巴细胞没有产生免疫应答，实验必然失败；（2）融合实验最大的失败原因是污染，所以确保操作环境的无毒无菌至关重要。