第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定

相对定量法用于测定不同样品中基因表达量的相对值。在选择内参基因时，需遵循以下原则：

• 始终选择表达量高且稳定的基因作为内参基因；
• 避免盲目选择常用的内参基因；
• 常见的内参基因包括GAPDH、Actin和Tubulin。

内参基因的选择对结果的有效性至关重要。在加入内参基因后，随后进行结果计算。

二、绝对定量

绝对定量法通过标准品测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。标准品包括：

• A/克隆质粒；
• B/PCR产物；
• C/cDNA（用于扩增效率测定等，但绝对定量时不适用）。

拷贝数的计算涉及平均分子量（MW）的确定：

• dsDNA = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)；
• ssDNA = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)；
• ssRNA = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)。

拷贝数的计算公式为：

(6.02 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度[g/ml]) / (MW[g/mol]) = copies/ml

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