尊龙凯时为您提供的RFL-6大鼠成纤维细胞培养指导，帮助您的实验获得最佳效果。以下为详细的细胞培养说明：

一、细胞培养条件

细胞名称：RFL-6大鼠成纤维细胞

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：DMEM+10%FBS+1%双抗

传代方法：第一次建议1:2传代

传代情况：每2天更换培养基

备注：使用无菌离心管收集培养基以便进行过渡对比。如果对比培养效果不佳，建议直接采购我们的完全培养基。

二、细胞处理步骤

收到细胞后，将其培养至良好状态，灌满完全培养液并密封瓶口，以确保在运输过程中的细胞最佳状态。收到细胞后，使用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，随后放置于超净台内进行无菌操作。将细胞瓶置入37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，待细胞状态稳定后再进行处理。用显微镜观察细胞生长情况，并拍照保存不同倍数的细胞图像（最好为40x,100x,200x各一张），前三天的照片将作为售后依据，不提供照片则默认收到的状态良好。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

在细胞未达到80%汇合度时，收集培养瓶中的完全培养液至离心管中，保留5ml培养基并放入37℃、5%CO2的孵箱培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代。

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。根据显微镜观察细胞状态，若细胞大部分脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，并补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例进行分瓶传代，将悬液均分至两个T25瓶，补充5-8ml完全培养基，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至培养瓶80%覆盖时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次；
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，轻轻摇晃观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞放入-80℃冰箱，若后续需转入液氮罐中，则需在-80℃30小时以上。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护装备），快速放入37℃水浴中解冻，直至无结晶，然后用75%的酒精擦拭管外壁；
2. 将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；
3. 弃上清，用5ml完全培养基重悬，接种于T25培养瓶，放入37℃、5%CO2的细胞培养箱培养；
4. 第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

有些细胞在运输过程中可能会有所脱落，这是正常现象。如细胞脱落较多，可以将培养瓶内的所有培养液收集至离心管中，1000rpm离心5分钟。收集的上清液可用于过渡培养。沉淀后加入1-2ml胰蛋白酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。再离心，弃上清，重悬后按照1:2比例进行分瓶传代并补充完全培养基。

五、售后条款

尊龙凯时承诺提供高质量的细胞产品。若细胞出现问题，重发情况包括但不限于：运输过程中细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等。细胞污染问题需在收到产品48小时内反馈，相关证据需提供以便核实后进行重发。关于细胞活性问题，请在收到产品7天内反馈并提供详细实验结果。

若客户因操作不当、使用非推荐培养体系等原因造成细胞状态不良，我方将不予重发。请在收到细胞后及时反馈状态并保存培养前的照片以便后续核查。